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使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行基因表達分析的實驗步驟

更新時間:2025-06-23      點擊次數(shù):162
使用高容量 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行基因表達分析,主要包括 RNA 樣本準備、逆轉(zhuǎn)錄反應和后續(xù)分析三個階段。以下為你詳細介紹具體實驗步驟:


  1. RNA 樣本準備

    • 樣本收集與保存:根據(jù)實驗目的收集合適的生物樣本,如細胞、組織或體液等。收集后,立即將樣本置于 RNA 保護劑中,或液氮速凍后轉(zhuǎn)移至 - 80°C 冰箱保存,防止 RNA 降解。

    • RNA 提取:使用合適的 RNA 提取試劑盒,如 TRIzol 試劑、硅膠膜柱式提取試劑盒等,按照說明書操作從樣本中提取總 RNA。提取過程中注意避免 RNA 酶污染,使用無 RNA 酶的耗材和試劑,操作在冰上進行以減少 RNA 降解。

    • RNA 質(zhì)量檢測:通過分光光度計測定 RNA 濃度和純度,A260/A280 比值應在 1.8 - 2.0 之間,A260/A230 比值應大于 2.0,比值偏離范圍表明可能存在蛋白質(zhì)、酚類或鹽類污染。同時,進行瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 完整性,觀察 28S 和 18S rRNA 條帶是否清晰、亮度比例是否約為 2:1,若條帶彌散則提示 RNA 降解。

  2. 逆轉(zhuǎn)錄反應

    • 試劑準備:從低溫冰箱取出高容量 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,置于冰上解凍。準備無 RNA 酶的 PCR 管、移液槍及槍頭。

    • 反應體系配制:在 PCR 管中依次加入以下試劑(以 20μl 反應體系為例):2μg 總 RNA、1μl 隨機引物或 1μl oligo (dT) 引物(根據(jù)樣本類型選擇)、4μl 5×RT Buffer、1μl 10mM dNTP Mix、1μl RNase Inhibitor、1μl Reverse Transcriptase,最后用無 RNA 酶水補足至 20μl。輕輕混勻,短暫離心使反應成分集中于管底。

    • 逆轉(zhuǎn)錄反應程序:將 PCR 管放入 PCR 儀,設置反應程序:25°C 孵育 10 分鐘(引物退火);37°C 孵育 120 分鐘(逆轉(zhuǎn)錄反應);70°C 孵育 15 分鐘(酶失活)。反應結(jié)束后,cDNA 產(chǎn)物可立即用于后續(xù)實驗,或保存于 - 20°C 備用。

  3. 后續(xù)基因表達分析

    • 引物設計:根據(jù)目的基因序列,使用專業(yè)引物設計軟件(如 Primer Premier、NCBI Primer - BLAST)設計特異性引物,引物長度一般為 18 - 25bp,Tm 值在 58 - 62°C 之間,GC 含量 40 - 60%。同時設計內(nèi)參基因(如 β - actin、GAPDH)引物,用于數(shù)據(jù)歸一化。

    • 反應體系配制:在 PCR 管中依次加入:10μl 2×qPCR Master Mix、0.5μl 上游引物(10μM)、0.5μl 下游引物(10μM)、1μl cDNA 模板,用無 RNase 水補足至 20μl。輕輕混勻,短暫離心。

    • qPCR 反應程序:將 PCR 管放入實時熒光定量 PCR 儀,設置反應程序:95°C 預變性 3 分鐘;95°C 變性 15 秒,60°C 退火 / 延伸 30 秒,共 40 個循環(huán)。反應結(jié)束后,分析擴增曲線和熔解曲線,確保擴增特異性。

    • 數(shù)據(jù)分析:采用 2-ΔΔCt 法計算目的基因相對表達量。首先計算每個樣本目的基因與內(nèi)參基因 Ct 值的差值(ΔCt),再計算實驗組與對照組 ΔCt 的差值(ΔΔCt),最后根據(jù)公式 2-ΔΔCt 得出目的基因相對表達倍數(shù)。

    • 實時熒光定量 PCR(qPCR)

    • 基因芯片分析:將逆轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 進行標記(如采用熒光染料標記),標記后的 cDNA 與基因芯片上的探針進行雜交,經(jīng)過洗滌、掃描等步驟,獲取基因芯片圖像。使用專業(yè)軟件分析圖像數(shù)據(jù),得到每個基因的熒光信號強度,通過標準化處理后,分析基因表達差異,篩選出上調(diào)或下調(diào)基因。

    • 轉(zhuǎn)錄組測序(RNA - seq):將 cDNA 構建測序文庫,利用高通量測序技術進行測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制、比對到參考基因組或轉(zhuǎn)錄組、定量分析等步驟,得到基因表達譜。通過差異表達分析、富集分析等生物信息學方法,深入研究基因表達變化及其功能意義 。



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