凝膠制備優(yōu)化

• 選擇合適的凝膠濃度：根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子量范圍選擇最佳凝膠濃度。小分子蛋白質(zhì)（<20>100 kDa）則選用 7%-10% 的低濃度凝膠。對于分子量范圍較寬的樣品，可使用梯度凝膠（如 4%-20%）實現(xiàn)更廣泛的分離。

• 確保凝膠聚合質(zhì)量：控制聚合溫度在 20-25℃，避免溫度波動影響凝膠孔徑均一性。過硫酸銨（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）的添加量要精確，過量會導(dǎo)致凝膠脆化，不足則聚合。建議新鮮配制 APS 溶液，并在 1 周內(nèi)使用。

電泳條件優(yōu)化

• 降低電泳溫度：高溫會導(dǎo)致蛋白質(zhì)擴散加劇，條帶變寬。可采用以下措施降溫：在冰浴中進(jìn)行電泳、使用循環(huán)冷卻水系統(tǒng)或降低電泳電壓延長電泳時間。例如，將電壓從 200V 降至 100V，雖然電泳時間延長，但條帶更清晰。

• 優(yōu)化緩沖液系統(tǒng)：使用 Tris - 甘氨酸緩沖液時，確保 pH 值在 8.3 左右。定期更換電泳緩沖液，長時間使用會導(dǎo)致離子強度變化，影響分辨率。對于高分辨率需求，可考慮使用 MOPS 或 MES 緩沖系統(tǒng)，尤其適用于小分子蛋白質(zhì)分離。

樣品處理改進(jìn)

• 精確控制上樣量：過量上樣會導(dǎo)致條帶拖尾和重疊。一般每孔上樣量為 10-20μg 總蛋白，對于純化的蛋白質(zhì)樣品，5-10μg 即可。使用微量移液器確保上樣量準(zhǔn)確，并避免樣品溢出至相鄰孔。

• 優(yōu)化樣品煮沸時間：樣品與上樣緩沖液混合后，煮沸時間控制在 5-10 分鐘。過長時間煮沸可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，影響分離效果。對于含二硫鍵較多的蛋白質(zhì)，可適當(dāng)延長煮沸時間至 10 分鐘。

儀器與耗材選擇

• 使用高質(zhì)量的預(yù)制膠：預(yù)制膠的凝膠濃度和聚合條件經(jīng)過嚴(yán)格控制，重復(fù)性好，可減少因手工制膠導(dǎo)致的分辨率差異。選擇信譽良好的品牌，確保凝膠質(zhì)量穩(wěn)定。

• 清潔電泳設(shè)備：電泳槽和梳子使用后需清洗，殘留的 SDS 和蛋白質(zhì)會干擾后續(xù)實驗?？上扔?0.1% SDS 溶液浸泡，再用蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。

特殊技術(shù)應(yīng)用

• 使用梯度凝膠：梯度凝膠的孔徑從頂部到底部逐漸減小，能夠在同一凝膠上分離不同分子量范圍的蛋白質(zhì)，提高分辨率。尤其適用于復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的分離。

• 采用雙向電泳：結(jié)合等電聚焦和 SDS-PAGE 的雙向電泳技術(shù)，可將上千種蛋白質(zhì)在二維平面上分離，顯著提高分辨率和蛋白質(zhì)檢測靈敏度。